A nukleinsav szintézis elvei

A nukleinsavszintézist a szilárd fázisú sziálsav-amid-triglicerid módszerrel hajtják végre, ahol a DNS 3'-végét szilárd fázisú szubsztrátra rögzítik, és nukleotidokat adnak hozzá 3'-5' irányban, amíg a kívánt DNS-fragmens meg nem szintetizálódik. .Ez különbözik a DNS-szintézistől a DNS-polimeráz alkalmazásával.

Az első bázis 3'-végét CPG-n immobilizáljuk a szintézis során, a következő bázis 5'-OH-ját di-p-tolil-tritil-DMT-vel, a bázis aminocsoportját benzoesavval, a 3'-OH-t pedig benzoesavval védjük. Az -OH-t ezután amino-foszfát vegyülettel aktiválják.Az 1 bázis 5 5'-OH-jának 1 bázisa és a következő bázis 3'-OH-ja foszfit-trigliceridet képez, amelyet jóddal foszfát-trigliceriddé oxidálnak, a második bázis 5'-OH védőanyagát eltávolítják diklór-ecetsav hozzáadása DM ciklus a következő bázis hozzáadásával, majd a szintézis után az 5'-OH védőanyagát gyenge savval eltávolítjuk A fragmenst tömény ammónium-hidroxiddal leválasztjuk a szilárd gyantáról, a védőanyagot a bázisról eltávolítjuk. tömény ammónium-hidroxiddal melegítés közben az ammónium-hidroxidot eltávolítjuk, a fragmentumot vákuumban szárítjuk, és a nukleinsavat folyadékkromatográfiával vagy PAGE-val tisztítjuk.

Az oligoszintézis lépései

Blokkolás feloldása

AAz 5 végű DMT védőcsoportot TCA oldat hozzáadásával távolítjuk el.

Aktiválás

Az aktivátort összekeverjük az oligonukleotid monomerrel az aktív oligonukleotid monomer intermedier előállítására.

Csatolás

Az 5-terminális hidroxilcsoport reagál az aktív oligonukleotid intermedierrel egy antigeneratív kondenzációs reakcióban, és instabil foszfit-triglicerid kötést hoz létre.

Kupakolás 

Lezáró szer hozzáadása acetilezési lezárási reakciót hajt végre a kondenzációs reakcióban nem részt vevő hidroxilcsoportok feleslegével.

Oxidáció 

A vizet tartalmazó jódos oldat hozzáadása instabil foszfitkötésekkel reagál oxidáció útján, és stabil foszforsav-triglicerid kötéseket hoz létre.

Cianoetil hasítás

A nukleinsav termék szintézis után, DEA-oldat hozzáadásával a ciano-etilcsoport eltávolítására a foszfát-triglicerid kötésből.

Hasított és védelem eltávolítása

A nukleinsav-fragmenseket tömény ammónium-hidroxid-oldat hozzáadásával lehasítjuk a szilárd fázisú hordozóról, majd melegítjük, hogy eltávolítsuk a védőcsoportokat a bázisok hidrogénkötéseiből.